利用细胞拉伸仪机械刺激肺泡上皮成纤维细胞模型研究肺部疾病机制

更新时间：2025-12-19

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一、研究背景与科学问题

肺部机械微环境的重要性

：肺部在呼吸周期中持续承受周期性机械力（压缩、剪切应力、拉伸），正常生理条件下潮汐呼吸诱导约 4% 单轴应变，深呼吸时应变可达 25%，肺泡表面积增加 27%-37%。这些机械信号对肺泡功能维持、细胞信号传导及组织稳态至关重要，而病理状态下（如哮喘、慢阻肺、肺纤维化、呼吸机诱导肺损伤）机械力失衡会破坏细胞功能，引发炎症与纤维化。

现有体外模型的局限

：传统二维（2D）单培养模型无法模拟肺部多细胞交互及三维（3D）机械微环境，难以准确复现体内上皮 - 间充质对话及机械力介导的病理过程，导致对肺部疾病机制的研究存在偏差。

核心科学问题

：构建基于 Flexcell 张力系统的 2D/3D 肺泡上皮 - 成纤维细胞共培养及类器官模型，验证病理机械刺激（18% 振幅、0.4Hz、24h）对细胞增殖、形态、细胞骨架、紧密连接、炎症因子释放及细胞死亡的影响，为肺部疾病机械病理机制研究提供更贴近体内的体外模型。

二、实验材料与方法

细胞模型与培养条件

细胞系
：人肺泡上皮细胞系 A549（CCL-185）、人肺成纤维细胞系 MRC-5（CCL-171），均购自 ATCC；A549 使用至第 25 代，MRC-5 使用至第 16 代以维持细胞特性，培养于含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 链霉素（P/S）的 DMEM 培养基，37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养。
细胞计数与活力检测
：采用 Countess™3 自动细胞计数器结合台盼蓝排斥法，确保实验起始细胞活力一致

2D/3D 模型构建

2D 模型（共培养与单培养）

单培养：在胶原 I 包被的 6 孔 BioFlex 柔性底板培养板中，每孔接种 1×10⁵个 A549 或 MRC-5 细胞，贴壁 24h 后换用 1% FBS 培养基。
共培养：每孔共接种 5×10⁴个 A549+5×10⁴个 MRC-5 细胞，培养条件同单培养

3D 模型（共培养与类器官）

3D 共培养：在 6 孔 Tissue Train 圆形泡沫培养板中，将 1×10⁵个 MRC-5 细胞悬浮于 2mg/mL 大鼠尾胶原 I 中，聚合 1h 后，在胶原凝胶表面接种 2×10⁵个 A549 细胞，24h 形成融合层。
3D 类器官：24 孔板先包被 40% 基质胶 + 60% DMEM（10% FBS），聚合后接种 3×10⁵个 A549+3×10⁴个 MRC-5（含 5% 基质胶），培养 21 天（每 2 天换液），通过 Fiji 软件监测类器官数量、直径及面积；第 21 天用 Cultrex™类器官收集液收获，嵌入 2mg/mL 胶原 I 后换用 1% FBS 培养基用于机械刺激实验。

机械刺激与检测技术

Flexcell 张力系统参数
：采用 FX-6000 张力系统施加等双轴应变，病理刺激参数为 18% 振幅、0.4Hz、持续 24h；对照组维持静态培养，通过真空压力使柔性膜围绕固定柱变形，实现细胞均匀拉伸（图 1）。
免疫荧光分析
：固定（4% 多聚甲醛）、透化（0.2% Tween 20）后，用 Alexa Fluor™594 标记 ZO-1 抗体（紧密连接标志物）、Alexa Fluor™488 标记鬼笔环肽（F-actin，细胞骨架）、DAPI（细胞核）染色；Leica DMi8 共聚焦显微镜（40× 物镜）用于荧光强度分析，EVOS M500 荧光显微镜（10× 物镜）用于形态分析，量化细胞数量、F-actin/ZO-1 荧光强度及细胞形态比例。

炎症因子与细胞死亡检测

酶联免疫吸附实验（ELISA）：采用 R&D Systems 试剂盒检测上清中 IL-6（D6050）、IL-8（DY208）浓度，BioTek Cytation 7 酶标仪定量。
乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验：使用 CyQUANT™LDH 检测试剂盒（C20300），通过重组人 LDH 标准曲线（1pg/mL-5ng/mL）量化上清中 LDH 释放，反映细胞裂解与死亡程度。

统计分析：采用 GraphPad Prism 10 软件，配对 t 检验分析两组差异，单因素 / 双因素 ANOVA 结合 Tukey 事后检验分析多组差异，结果以均值 ± 标准误（SEM）表示，至少 4 次独立实验，p<0.05 为差异显著。

三、核心实验结果

（一）2D 肺泡上皮 - 成纤维细胞模型对病理机械刺激的响应

细胞增殖与形态变化

增殖无显著差异
：机械刺激后，A549 与 MRC-5 细胞总数与对照组无显著差异，提示 2D 环境下病理拉伸不促进细胞增殖（图 3C）。
形态特异性改变
：成纤维细胞（MRC-5）在刺激后纺锤形比例显著升高（81.0±4.0% vs 对照组 26.2±2.7%，p=0.0006），上皮细胞（A549）仍以立方形态为主，无显著形态转变（图 3F）；单培养模型中趋势一致，成纤维细胞纺锤形比例达 85.7±1.4%（对照组 18.0±1.8%），证实机械刺激对成纤维细胞形态的调控具有细胞类型特异性。

细胞骨架与紧密连接变化

F-actin 强度降低
：共培养中，A549 与 MRC-5 的 F-actin 荧光强度均显著低于对照组；单培养中两种细胞 F-actin 强度同样降低，但共培养中 A549 的 F-actin 强度显著高于单培养（p=0.0006），提示上皮 - 成纤维细胞交互可部分代偿机械刺激导致的细胞骨架损伤（图 3D、补充图 1B）。
紧密连接蛋白 ZO-1 下调
：A549 细胞的 ZO-1 荧光强度在共培养与单培养中均显著降低，且共培养中降低幅度更小（p=0.01），表明多细胞交互可部分保护上皮屏障功能（图 3E、补充图 2C）。炎症因子与细胞死亡

炎症因子释放增加

：刺激后上清中 IL-6、IL-8 浓度显著升高（图 3G-H）；单培养中，成纤维细胞 IL-6 释放显著增加，上皮细胞与成纤维细胞 IL-8 释放均显著升高，证实两种细胞均为炎症因子的来源（补充图 2C-D）。

细胞死亡加剧
：LDH 释放量显著高于对照组（图 3I）；单培养中两种细胞 LDH 均升高，但组间无显著差异，提示 2D 环境下机械刺激对两种细胞的毒性作用相当（补充图 2E）。

（二）3D 肺泡上皮 - 成纤维细胞共培养模型对病理机械刺激的响应

细胞增殖与形态差异
上皮细胞增殖增加
：刺激后 A549 细胞数量显著升高，MRC-5 数量无显著变化，与 2D 模型形成对比，证实 3D 环境更易诱导机械刺激介导的上皮细胞增殖（图 4B）。
成纤维细胞形态反转
：成纤维细胞纺锤形比例显著降低（34.6±2.8% vs 对照组 61.6±1.8%，p=0.05），更多呈现宽展的肌成纤维细胞样形态，提示 3D 胶原凝胶环境可能促进成纤维细胞活化（图 4E）；A549 仍维持立方形态，无显著变化。
细胞骨架、紧密连接与功能指标
F-actin 无显著变化
：与 2D 模型不同，3D 共培养中 A549 与 MRC-5 的 F-actin 强度与对照组无显著差异，表明 3D 基质可缓冲机械刺激对细胞骨架的破坏（图 4C）。
ZO-1 显著下调
：A549 的 ZO-1 强度降低 45.2%，与 2D 模型一致，证实机械刺激对上皮紧密连接的破坏具有模型通用性（图 4D）。
炎症与细胞死亡
：IL-8 浓度显著升高，IL-6 无显著变化；LDH 释放显著增加，且高于 2D 模型（约 50%），提示 3D 环境下细胞对机械刺激的毒性更敏感（图 4F-H）。

（三）肺泡上皮 - 成纤维细胞类器官模型的发育与机械响应

类器官发育特征
：培养 21 天期间，类器官数量随时间减少（第 3 天 vs 第 9/21 天，p<0.001），面积与直径显著增加（第 3 天 vs 第 9/21 天，p<0.001），呈现 “数量减少 - 体积增大" 的成熟趋势，第 21 天类器官形态稳定，适合机械刺激实验（图 5A-D）。
机械刺激后的类器官响应
数量与形态变化
：刺激后类器官数量增加 42%，面积减少 43%；成纤维细胞形成 F-actin 阳性胞质突起，破坏类器官球形结构，提示机械刺激诱导细胞向外迁移（图 5F-G）。
细胞骨架与紧密连接
：F-actin 荧光强度显著升高，且类器官中心区域强度高于周边（补充图 3A）；ZO-1 强度显著降低，且全层（Z 轴）均下调（补充图 3B），证实机械刺激对类器官细胞骨架的激活与屏障功能的破坏。
炎症与细胞死亡
：IL-6 浓度显著升高，IL-8 升高但无统计学差异；LDH 释放显著增加，与 3D 共培养趋势一致（图 5J-L）。

四、研究结论与意义

核心结论

模型特异性响应
：病理机械刺激（18%、0.4Hz、24h）对肺泡细胞的调控具有模型依赖性 ——2D 模型抑制细胞骨架、不促进增殖，3D 模型（共培养 / 类器官）诱导上皮增殖、成纤维细胞活化、更强的炎症与细胞死亡，且类器官能复现细胞空间异质性响应（中心 vs 周边 F-actin 差异）。
共性损伤效应
：所有模型中机械刺激均下调紧密连接蛋白 ZO-1（破坏上皮屏障）、增加炎症因子（IL-6/IL-8）释放及细胞死亡，证实机械力失衡是肺部病理的关键诱因。
上皮 - 成纤维细胞交互作用
：共培养模型中，上皮与成纤维细胞的交互可部分代偿机械刺激导致的细胞骨架损伤（2D 中 A549 F-actin 更高）及紧密连接破坏（ZO-1 降低幅度更小），凸显多细胞模型的重要性。
研究意义

模型价值：构建的 Flexcell-based 2D/3D 模型可模拟肺部病理机械微环境，其中 3D 模型（尤其是类器官）更贴近体内肺泡结构，为研究机械介导的肺部炎症、纤维化机制提供可靠体外平台。

临床转化潜力：模型可用于筛选针对机械病理通路的药物（如抑制成纤维细胞活化、保护上皮屏障的药物），为慢阻肺、肺纤维化等疾病的治疗提供新靶点验证工具。